如何選擇正確的方法進行細胞的支原體檢測？支原體的檢測方法有哪些？目前實驗室常用的支原體檢測方法有培養(yǎng)法、熒光指示細胞法、PCR法、掃描電子顯微鏡法，這些方法各有優(yōu)缺點。各實驗室可根據(jù)具體情況，選擇不同的方法，或幾種方法聯(lián)合使用。一、培養(yǎng)法培

如何選擇正確的方法進行細胞的支原體檢測？支原體的檢測方法有哪些？目前實驗室常用的支原體檢測方法有培養(yǎng)法、熒光指示細胞法、PCR 法、掃描電子顯微鏡法，這些方法各有優(yōu)缺點。各實驗室可根據(jù)具體情況，選擇不同的方法，或幾種方法聯(lián)合使用。

一、培養(yǎng)法

培養(yǎng)法為最為經(jīng)濟可靠的方法，但其實驗周期較長，所以常用來進行對懷疑細胞的最后甄別。常用于細胞及臨床治療細胞的支原體檢查。

（一）材料與設備

1. 精氨酸肉湯培養(yǎng)基 按說明稱量粉劑，蒸餾水配制， 高壓除菌（加20％胎牛血清）。2. 支原體瓊脂培養(yǎng)基 按說明稱量粉劑，蒸餾水配制，高壓除菌（加20％胎牛血清）。3. 其他 超凈工作臺、無菌吸管、試管架、培養(yǎng)試管／皿、37°C 培養(yǎng)箱。

（二）操作步驟

1. 樣品的儲存。樣品取材后，最好盡快進行檢測。樣品如在24h 以內(nèi)進行支原體檢測， 可儲存在2~8℃; 如果超過24h 樣品應放置于－20℃ 以下保存。-20℃保存的樣品，進行檢測時需重新加入到對照培養(yǎng)細胞中，培養(yǎng)72h 后，取上清直接進行接種檢測。2. 準備精氨酸肉湯培養(yǎng)基、支原體瓊脂培養(yǎng)基（半流體）。3. 將樣品分別接種到10ml 精氨酸肉湯培養(yǎng)基、半流體培養(yǎng)基中（已冷卻至36℃） ，每支培養(yǎng)基接種樣品0.5~ 1.0ml. 每種樣品接種6 支精氨酸肉湯培養(yǎng)基，3 支半流體培養(yǎng)基。4. 接種6d 后，取3 支精氨酸肉湯培養(yǎng)基中樣品0.5 ~ 1.0ml. 復種于精氨酸肉湯培養(yǎng)基中。5. 36 ℃ 培養(yǎng)29d, 每隔3d 觀察一次。記錄實驗結(jié)果。

（三）結(jié)果判斷

培養(yǎng)結(jié)束時，精氨酸肉湯培養(yǎng)基如有支原體生長，則液體顏色改變（粉色或黃色) 。半流體培養(yǎng)基中如有支原體生長，則出現(xiàn)絮狀沉淀

二、熒光指示細胞法

熒光指示細胞法較為快捷，方法簡單，但其靈敏度有一定的欠缺， 易造成漏檢。

常見的支原體檢測方法中最簡單、最經(jīng)濟的方法是熒光指示細胞法。該方法使用的熒光染料是煙酸己可堿，其激發(fā)波長為350nm（紫外激發(fā)），發(fā)射波長為420nm。該染料會結(jié)合到DNA 中富含A-T 的區(qū)域，由于支原體的DNA中A-T 含量占多數(shù)(55%~80%），所以可被染色而檢測到。支原體污染的細胞經(jīng)染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點，即為支原體DNA, 證明該細胞有支原體污染。

（一）材料與設備

1. 熒光顯微鏡。2. CO2 培養(yǎng)箱。3. 無菌小爬片。4. 無菌培養(yǎng)皿。5. 不含抗生素的完全培養(yǎng)液。6. 二苯甲酰胺熒光染料濃縮液(50μg/ml) 。稱取5mg 二苯甲酰胺熒光染料加入100ml 不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液中，在室溫下用磁力攪拌30~40min, 使完全溶解，－20℃ 避光保存。7. 二苯甲酰胺熒光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1ml 上述濃縮液，加至100ml 無酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 溶液中，終濃度為0.5μg/ml 。8. 固定液，即乙酸：甲醇(1 : 3) 溶液為細胞固定液。9. 封片液。0.1mol/L枸櫞酸22.2ml, 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml，以上三者混勻，調(diào)pH 至5.5 。10.不含酚紅和碳酸氫鈉的Hanks 平衡鹽溶液或PBS。經(jīng)多種方法檢測確定為支原體陰性的VERO 細胞。

（二）操作步驟1. 無菌收集待測細胞上清：懸浮細胞離心后取上清液。2. VERO 細胞爬片：將小爬片無菌置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加VERO 細胞懸液(細胞濃度約3×104 個/ml) 2~3ml, 置于CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h 使其貼壁。3. 制備標本。向6 孔板內(nèi)滴加待檢細胞上清液約1ml, 注意設立對照組（已證實的支原體陽性和陰性細胞上清液），培養(yǎng)48h 后( VERO 細胞匯合前）將細胞爬片從平皿中取出。4. 漂洗—將細胞爬片置于培養(yǎng)皿中，用不含酚紅、NaHCO3 的Hanks 溶液（或PBS) 漂洗3次。5. 固定—用乙酸：甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。6. 漂洗—待固定液自然風干后用去離子水漂洗3 次。7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。8. 漂洗—去離子水中漂洗3 次，每次1 ~2min 。9. 封片，紫外激發(fā)，觀察。

（三）結(jié)果判斷當陰性及陽性對照結(jié)果均成立時，結(jié)果有效 。1. 陰性結(jié)果 僅見待檢細胞的細胞核呈現(xiàn)藍色熒光。2. 陽性結(jié)果 熒光顯微鏡下細胞周圍或細胞膜表面可見大小不等、不規(guī)則的藍色熒光小點和絲狀點。

（四）小結(jié)1. 嚴格配制工作液及封片液。2. 保證作為指示細胞的VERO 細胞沒有被支原體污染。3. 必須同時設立陽性及陰性對照， 注意重復，以排除假陽性和假陰性結(jié)果。4. 應全面觀察爬片，并注意可疑陽性的熒光點是凋亡小體還是支原體污染。5. 可適當調(diào)整熒光染料的工作濃度和染色時間，避免出現(xiàn)非特異性染色，如胞漿著色。

三、PCR 法

PCR 法檢測支原體的方法最為快速、靈敏、取樣量少，既可做細胞本身，也可做細胞上清的檢測，同時可以檢測多種支原體的污染，是目前常用的檢測手段。但其成本較高，條件要求嚴格，且有時易出現(xiàn)假陽性或假陰性。彌補的方法是對懷疑的樣品要經(jīng)過3 次PCR 檢測，或用培養(yǎng)法檢測。

PCR 法是20 世紀80 年代中期建立起來的一種體外DNA 擴增實驗，其基本原理是酶促DNA 合成反應，即在DNA 模板、引物和脫氧核糖核酸存在下，經(jīng)DNA 聚合酶的作用，使DNA 鏈擴增延伸。該實驗具有靈敏度高、特異性強、檢測快速的特點，但其對實驗環(huán)境要求嚴格， 實驗成本較高， 有時還會出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。

（一）材料與設備支原體

PCR 檢測試劑盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、緩沖溶液、瓊脂糖、礦物油、超凈工作臺、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、臺式離心機、旋渦混旋器等。

（二）操作步驟

1. 樣品的收集。待測細胞用無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)7d，用無菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待測。2. 模板的制作。在無菌的條件下， 取細胞培養(yǎng)上清1 00μl 于一無菌的0.5ml塑料離心管內(nèi)，蓋好蓋子， 95 ℃ 水浴加熱5min 。3. 打開蓋子，向管內(nèi)加StrataClean Resin 10μl，蓋好蓋子，旋渦混懸器混合，離心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料離心管中，模板制作完畢， 4℃ 保存。4. PCR 反應。反應體系的最適條件為10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶，總反應體系為50μl ， 反應用去離子水均需用紫外燈照射。（1）在0.5ml 塑料離心管中加入35.2μl 去離子水及5μl 10 xTaq 反應緩沖溶液。（2）依次加入下列成分：0.4μl dNTP (25mmol/L）、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。（3）加2μl 去離子水，總體積45μl 。（4）加5μl 已制成的模板到反應體系中。（5）陽性對照，內(nèi)對照各5μl 加入到各自的反應體系中。（6）取1支含有以上反應體系的離心管，加入5μl 去離子水作為陰性對照管。（7）在反應體系中加入100μl 礦物油。（8）PCR 程序見下表。

5. 瓊脂糖凝膠電泳。PCR 反應結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為2%。電泳結(jié)束后，凝膠成像分析結(jié)果。6. 結(jié)果分析。該方法為檢測支原體的定性方法，在電泳泳道上， Marker、陽性對照、內(nèi)對照均會出現(xiàn)不同的電泳條帶， 當被檢樣品泳道出現(xiàn)明亮條帶，且位置在陽性對照和內(nèi)對照條帶位置之間，即可認為該樣品被支原體污染 。有時還會發(fā)現(xiàn)一條泳道出現(xiàn)多條，可能是該樣品感染2 種以上支原體所致。如果泳道內(nèi)條帶隱約出現(xiàn)，則可懷疑有支原體污染，重做該樣品。

（三）注意事項PCR 反應的前期操作應在無菌環(huán)境中進行。注意假陽性、假陰性，有時需多次重復。

四、掃描電子顯微鏡法

掃描電子顯微鏡法：掃描電子顯微鏡法非常直觀、準確，對使用環(huán)境要求高，操作復雜，實驗周期較長，常作為樣品的最后定性檢測。

（一）原理

利用電子顯微鏡的超級放大功能， 直接觀察培養(yǎng)細胞中支原體污染情況。

（二）材料與設備

待檢測細胞， 0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 、2.5％的戊二酸、1％鋨酸、0.1mol/L磷酸緩沖溶液（ pH7.4 ) ，掃描電鏡及相關(guān)設備。

（ 三）操作步驟

1. 將待檢測細胞傳代至貼有蓋玻片的培養(yǎng)皿中。2. 37°C , CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h , 取出蓋玻片。3. 以PBS 洗滌3 次。4 . 以2 .5％戊二醛/PBS 固定15min , PBS 洗滌。5 ．以1％鋨酸固定30min, PBS 洗滌。6 . 乙酸異戊酯脫水。7. CO2 冰點干燥。8. 噴金。9 . 掃描電鏡觀察，照相。

（四）結(jié)果分析

支原體感染會使培養(yǎng)細胞慢慢枯萎，因此對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應該進行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅持下去，是細胞培養(yǎng)實驗室應對支原體感染的關(guān)鍵。

作者：海星生物公眾號：Cas9X細胞基因敲除以上內(nèi)容由海星生物（http://www.cas9x.com)提供服務內(nèi)容：CRISPR/Cas9細胞基因編輯　載體構(gòu)建/病毒包裝 PDO/動物模型CDX　穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株 干細胞/原代細胞 培養(yǎng)試劑盒